給藥和治療方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括測(cè)定所述人的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的神經(jīng)纖維瘤蛋白-2(NF2)基因的基因產(chǎn)物，并且如果未檢測(cè)到基因產(chǎn)物或同工型1基因產(chǎn)物，則向所述人給藥有效量的粘著斑激酶(FAK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明還涉及在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括測(cè)定所述人的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的NF2基因的功能性同工型1蛋白質(zhì)或其功能性片段，并且如果未檢測(cè)到基因產(chǎn)物或同工型1基因產(chǎn)物，則向所述人給藥有效量的粘著斑激酶(FAK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
【專利說(shuō)明】給藥和治療方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及治療癌癥的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]粘著斑激酶(本文簡(jiǎn)稱為FAK)是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，其在粘著斑(focaladhesions)中具有信號(hào)傳導(dǎo)和支架的功能。FAK是細(xì)胞粘附、遷移和存活的中心調(diào)節(jié)因子(central regulator)。因此，F(xiàn)AK抑制為治療多種癌癥提供了重要途徑。在治療中，將對(duì)FAK抑制劑無(wú)響應(yīng)的患者與對(duì)FAK抑制劑響應(yīng)的患者分開(kāi)是重要的，以便可對(duì)無(wú)響應(yīng)患者提供替代治療。
[0004]附圖簡(jiǎn)述
[0005]圖1顯示了通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)到的多種細(xì)胞系中NF2的基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)圖像。圖1A顯示多種NF2同工型，而圖1B僅顯示NF2的同工型I。
[0006]圖2顯示人細(xì)胞系NC1-H2052 (NF2突變株，其中未檢測(cè)到merlin同工型I)和人細(xì)胞系MST0-211H(野生型NF2，其中檢測(cè)到merlin同工型I)中FAK[圖2A]和磷酸化的FAK(pFAK)[圖2B]的蛋白質(zhì)水平的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)圖像。
[0007]圖3顯示在5種間皮瘤細(xì)胞系和I種肺細(xì)胞系中NF2的同工型l(merlin同工型I)的蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物的免 疫組織化學(xué)檢測(cè)圖像(左圖為其中未檢測(cè)到merlin同工型I的細(xì)胞；右圖為其中檢測(cè)到merlin同工型I的細(xì)胞)。
[0008]圖4為按merlin同工型I狀態(tài)分類的經(jīng)化合物A治療的患者的Kaplan-Meier無(wú)進(jìn)展生存期圖。
[0009]圖5為經(jīng)化合物A治療的患者的治療持續(xù)時(shí)間的條線圖,其中標(biāo)注了 HierTlin同工型I的狀態(tài)。
[0010]圖6為在經(jīng)化合物A治療的患者中，在最佳響應(yīng)時(shí)的腫瘤測(cè)定中(研究者評(píng)估)，相對(duì)于基線的變化百分?jǐn)?shù)的柱狀圖(其根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定)，其中標(biāo)注了 merlin同工型I的狀態(tài)。
[0011]發(fā)明概述
[0012]本發(fā)明涉及在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括測(cè)定所述人的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的神經(jīng)纖維瘤蛋白_2(NF2)基因的基因產(chǎn)物，且如果未檢測(cè)到基因產(chǎn)物或同工型I基因產(chǎn)物，則向所述人給藥有效量的粘著斑激酶(FAK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明還涉及在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括測(cè)定所述人的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的NF2基因的功能性同工型I蛋白質(zhì)或其功能性片段，且如果未檢測(cè)到基因產(chǎn)物或同工型I基因產(chǎn)物，則向所述人給藥有效量的粘著斑激酶(FAK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0013]發(fā)明詳述
[0014]在機(jī)體的組織和器官中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)(cellularorganization)提供環(huán)境和骨架。ECM和組織細(xì)胞間的相互作用在發(fā)育、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞存活的調(diào)控中起著重要作用。細(xì)胞和ECM間或細(xì)胞-細(xì)胞間的異常相互作用可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變，提高細(xì)胞遷移、侵襲和生長(zhǎng)性質(zhì)，最終導(dǎo)致人類疾病形成。癌癥是失調(diào)的細(xì)胞遷移與生長(zhǎng)發(fā)展成侵襲性和轉(zhuǎn)移性疾病的人類疾病的最佳實(shí)例。
[0015]與ECM的細(xì)胞相互作用包括通過(guò)ECM組分銜接細(xì)胞受體的細(xì)胞粘附。ECM結(jié)合，或者更確切地說(shuō)纖維結(jié)合蛋白結(jié)合至跨膜整合素家族的蛋白質(zhì)，在該ECM-細(xì)胞界面處形成動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)簇，通常被稱為粘著斑復(fù)合體(focal adhesion complexes)(或粘著斑(focal contacts))。這些復(fù)合體將ECM與細(xì)胞骨架連接。在該界面處，結(jié)構(gòu)和信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合體的形成對(duì)該細(xì)胞具有重要的調(diào)節(jié)作用。據(jù)描述，許多具有支架和信號(hào)傳導(dǎo)性質(zhì)的蛋白質(zhì)集中于粘著斑上。所述非受體蛋白酪氨酸激酶，粘著斑激酶(FAK)，也稱為PKT2或蛋白酪氨酸激酶2，在粘著斑中具有信號(hào)傳導(dǎo)和支架的功能，并且已顯示作為該復(fù)合體、細(xì)胞粘附、遷移和生存的中心調(diào)節(jié)因子[1-3]。
[0016]FAK由研究者獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)，該研究者試圖了解整合素依賴性細(xì)胞粘附的控制，以理解貼壁依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)以及在腫瘤細(xì)胞情況中的非貼壁依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)[4，5]。其它研究者探索v-src癌基因的基質(zhì)以了解其轉(zhuǎn)化機(jī)理。作為src在粘著斑中的基質(zhì)和結(jié)合搭檔，F(xiàn)AK的發(fā)現(xiàn)提供了對(duì)非貼壁依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)和保護(hù)免受細(xì)胞失巢凋亡的機(jī)理的初步了解[6，7]。多項(xiàng)研究已將FAK表達(dá)水平和/或活化狀態(tài)與癌癥生成和進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。FAK的活化常?？赏ㄟ^(guò)磷酸化的FAK(pFAK)的水平，更確切地說(shuō)可通過(guò)酪氨酸397 (FAK的自磷酸化位點(diǎn)，也是src的結(jié)合位點(diǎn))磷酸化的pFAK的量推斷。更高水平的pFAK與癌癥的早期階段向更晚期階段轉(zhuǎn)變相關(guān)，且重要的是，與轉(zhuǎn)移性疾病相關(guān)[3，8，9]。
[0017]國(guó)際申請(qǐng)PCT/US2009/062163號(hào)，其國(guó)際申請(qǐng)日為2009年10月27日；國(guó)際公開(kāi)W02010/062578號(hào)，其國(guó)際
【公開(kāi)日】為2010年6月03日；公開(kāi)并要求保護(hù)2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1Η-吡唑-5-基]氨基}_4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺(此后稱為“化合物A”)，或其藥學(xué)上可接受的鹽，連同尤其是在癌癥的治療中用作FAK活性抑制劑的藥學(xué)上可接受的鹽，上述文獻(xiàn)的全部公開(kāi)內(nèi)容引入本文作為參考，且其中化合物A為實(shí)施例41a的化合物。
[0018]國(guó)際申請(qǐng)PCT/US/2008003235號(hào)，其國(guó)際申請(qǐng)日為2008年3月10日，國(guó)際公開(kāi)W02008/115369號(hào)，其國(guó)際
【公開(kāi)日】為2008年9月25日，描述了用作FAK活性抑制劑的其它化合物，上述文獻(xiàn)的全部公開(kāi)內(nèi)容引入本文作為參考。
[0019]化合物A正作為一項(xiàng)新的癌癥治療劑在人中進(jìn)行測(cè)試。期望能夠鑒別更可能對(duì)FAK抑制劑如化合物A響應(yīng)的基因型和表型。
[0020]II型神經(jīng)纖維瘤病(NF2)是一種遺傳性癌癥綜合征，其由該NF2 (神經(jīng)纖維瘤蛋白-2或merlin)基因的遺傳性種系突變所導(dǎo)致。所述NF2基因?yàn)槟[瘤抑制因子，且在NF2綜合征中觀察到腫瘤抑制功能異常或不存在。該綜合征的特征在于患者發(fā)展神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，包括神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤和室管膜瘤。腫瘤的發(fā)展伴有剩余等位基因的體細(xì)胞失活。還在大部分散在的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)NF2基因的突變，突出了該腫瘤抑制因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥中的重要性[10]。此外，NF2的純合突變(homozygous mutation)也在其它腫瘤類型中得以確認(rèn)，這些腫瘤類型包括:惡性間皮細(xì)胞瘤(50%)、甲狀腺腫瘤(17%)、膀胱腫瘤(11%)、皮膚腫瘤(5%)、胃腫瘤(5%)、骨腫瘤(3%)、腎腫瘤(2%)、乳腺腫瘤(2%)和腸道腫瘤(2%) [11]。而且最終，該NF2基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物(常稱為merlin)作為一種重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子已涉及調(diào)節(jié)src結(jié)合ErbB2并影響src_FAK通路[12]。這些觀察表明merlin可在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中起作用。
[0021]NF2基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物最常被稱為merlin，但也被稱為神經(jīng)纖維瘤蛋白-2。已描述Merlin的多個(gè)同工型，而同工型I和同工型2是最常見(jiàn)的[13]。據(jù)報(bào)道，同工型I隱匿NF2的腫瘤抑制活性并通過(guò)其它剪接外顯子16和外顯子17得到蛋白質(zhì)的不同羧基端而與同工型2區(qū)別。多項(xiàng)研究已鑒定了與merlin相互作用的跨膜蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，一些通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域，包括tr1-lobular amino terminal Four point one、埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)(FERM)結(jié)構(gòu)域相互作用。這些相互作用對(duì)于細(xì)胞骨架控制、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和細(xì)胞侵襲是重要的。在HIPPO信號(hào)傳導(dǎo)通路(在黑腹果蠅中闡釋的哺乳動(dòng)物中保守的通路)中，Merlin還與鄰近的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用[14]。HIPPO通路涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和器官大小。這些細(xì)胞活性的HIPPO通路調(diào)控允許merlin對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和進(jìn)展施加影響[13]。
[0022]惡性間皮細(xì)胞瘤是一種高度攻擊性且致命性疾病，其通常與暴露于石棉相關(guān)
[15]。間皮瘤的特征為非常具有侵襲性，并且在約40-50%的病例中，通過(guò)染色體22ql2處的染色體變化，NF2基因突變或者丟失。顯示在缺失NF2的間皮瘤細(xì)胞中merlin的強(qiáng)制表達(dá)(forced expression)抑制了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性以及侵襲性。也已顯示merlin的再表達(dá)會(huì)降低FAK的磷酸化并中斷與src和p85 (磷酸肌醇3-激酶的調(diào)節(jié)亞基)的結(jié)合。這些研究表明merlin的失活導(dǎo)致FAK活化并且其是間皮瘤發(fā)病機(jī)制中重要的一步[16]。
[0023]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一些NF2突變癌細(xì)胞或merlin陰性癌細(xì)胞比它們的野生型對(duì)應(yīng)物對(duì)FAK抑制劑更敏感；因此，可通過(guò)基于患者的NF2突變狀態(tài)或merlin同工型I表達(dá)狀態(tài)，例如基于存在或不存在NF2 的基因產(chǎn)物如merlin同工型I蛋白對(duì)患者進(jìn)行早期篩選以改善FAK抑制劑的有效性。
[0024]NF2基因和NF2基因突變
[0025]本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，其包括向患有一種或多種NF2突變的癌癥患者給藥在藥學(xué)上可接受的組合物中有效量的FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明還涉及在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括向所述需要治療的人給藥有效量的FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述人經(jīng)測(cè)定患有具有以下突變的癌癥:至少一種神經(jīng)纖維瘤蛋白2(NF2)突變，或?qū)е驴蓹z測(cè)量的NF2基因的基因產(chǎn)物(例如merlin同工型I蛋白質(zhì))不存在的任何突變，或?qū)е驴蓹z測(cè)量的NF2基因的功能基因產(chǎn)物(例如功能merlin同工型I蛋白質(zhì)或其片段)不存在的任何突變。與無(wú)該類突變的患者相比，向患有具有以下突變的癌癥的患者給藥FAK抑制劑使得一種或多種癥狀增強(qiáng):至少一種神經(jīng)纖維瘤蛋白2 (NF2)突變，或?qū)е驴蓹z測(cè)量的NF2基因的基因產(chǎn)物(例如merlin同工型I蛋白質(zhì))不存在的任何突變，或?qū)е驴蓹z測(cè)量的NF2基因的功能基因產(chǎn)物(例如功能merlin同工型I蛋白質(zhì)或其片段)不存在的任何突變。
[0026]野生型NF2基因(NM_000268和Gene ID:4771)的表達(dá)導(dǎo)致多基因產(chǎn)物即多種同工型的表達(dá)。例如，野生型NF2基因的表達(dá)導(dǎo)致至少NF2基因的同工型I和同工型2的表達(dá)。由于非野生型NF2基因具有一個(gè)或多個(gè)突變，該非野生型NF2基因的表達(dá)可導(dǎo)致NF2基因的一種或多種同工型的基因產(chǎn)物的表達(dá)不足。在一些實(shí)施方案中，NF2基因中的突變，即NF2突變，導(dǎo)致一種或多種基因產(chǎn)物或其片段不被表達(dá)成mRNA或蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，從需要癌癥治療的人獲得的樣品包含具有NF2突變的細(xì)胞，其中所述突變導(dǎo)致可檢測(cè)的mRNA轉(zhuǎn)錄物，該mRNA轉(zhuǎn)錄物不翻譯成蛋白質(zhì)，該突變導(dǎo)致未成熟終止密碼子(prematurestop codon)。在其它實(shí)施方案中，NF2突變導(dǎo)致mRNA和翻譯蛋白質(zhì)的表達(dá)不足，例如，由于染色體丟失或NF2基因的其它缺失導(dǎo)致的所述NF2突變。在其它實(shí)施方案中，所述NF2突變(例如，由于染色體丟失、NF2基因的缺失，或?qū)е挛闯墒旖K止密碼子的突變)，導(dǎo)致可檢測(cè)量的NF2同工型I表達(dá)不足或不存在。
[0027]在另外的實(shí)施方案中，所述NF2突變導(dǎo)致由所述NF2基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá)不足，其中所述蛋白質(zhì)為腫瘤抑制因子的同工型。在另一實(shí)施方案中，未被表達(dá)的所述腫瘤抑制因子同工型為NF2同工型I。在另一實(shí)施方案中，NF2基因中的突變導(dǎo)致NF2同工型I基因產(chǎn)物的表達(dá)不足。在另外的實(shí)施方案中，突變NF2基因的同工型I蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物未被表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，突變NF2基因的同工型I蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物不以可檢測(cè)的量存在。在另外的實(shí)施方案中，NF2同工型I蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物的功能片段，即在體內(nèi)或體外測(cè)量中保留腫瘤抑制活性的片段，不以可檢測(cè)的量存在。
[0028]在其它實(shí)施方案中，NF2基因的基因產(chǎn)物可被表達(dá)，即以可檢測(cè)的量存在，然而所述基因產(chǎn)物可能是非功能性的?；虍a(chǎn)物的功能缺失可以任何方式發(fā)生，且包括突變。因此，本發(fā)明還涉及在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括測(cè)定所述人的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的NF2基因的功能性同工型I蛋白質(zhì)或其功能性片段，并且如果未檢測(cè)到基因產(chǎn)物或同工型I基因產(chǎn)物，則向該人給藥有效量的粘著斑激酶(FAK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0029]在一些實(shí)施方案中，如果在從人獲得的癌癥中檢測(cè)到NF2突變，則向其給藥FAK抑制劑。在本文的方法中，其中腫瘤抑制同工型的表達(dá)不足，例如NF2同工型I的表達(dá)不足，所述方法包括向患有癌癥的人給藥FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。一項(xiàng)實(shí)施方案為在有需要的人中治療癌癥的方 法，其包括檢測(cè)所述癌癥中NF2基因的一種或多種同工型的表達(dá)，并且如果未檢測(cè)到腫瘤抑制同工型的表達(dá)，則給藥有效量的FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。本文的另一實(shí)施方案為在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括獲得所述癌癥的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的樣品，檢測(cè)所述樣品中NF2同工型I的表達(dá)，并且如果未檢測(cè)到所述NF2同工型1，則給藥有效量的FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一實(shí)施方案中，其中未檢測(cè)到NF2同工型I，所述檢測(cè)為NF2基因的同工型I蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物的檢測(cè)。本文的另一實(shí)施方案為在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括獲得所述癌癥的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的樣品，檢測(cè)所述樣品中存在或不存在NF2的同工型I和一種或多種其它同工型，并且如果未檢測(cè)到同工型1，則給藥有效量的FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0030]在其它實(shí)施方案中，野生型NF2的同工型I表達(dá)于需要治療癌癥的人的腫瘤或其樣品中。在另一實(shí)施方案中，所述NF2基因的野生型同工型I基因產(chǎn)物以可檢測(cè)的量存在。在另一實(shí)施方案中，所述野生型NF2的同工型I的片段以可檢測(cè)的量存在。在另一實(shí)施方案中，所述NF2基因的同工型I基因產(chǎn)物的片段為功能性片段，其中所述NF2的同工型I基因產(chǎn)物的片段保留了體外或體內(nèi)或體內(nèi)和體外的腫瘤抑制活性。在一些實(shí)施方案中，其中NF2的同工型I基因產(chǎn)物為蛋白質(zhì)或其功能性片段，而且所述同工型I蛋白質(zhì)以可檢測(cè)的量存在于人的樣品中，所述人經(jīng)2-[ (5-氯-2- {[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽治療，而且所述方法還包括加強(qiáng)對(duì)癌癥的監(jiān)測(cè)。在一些實(shí)施方案中，其中所述NF2同工型I基因產(chǎn)物為蛋白質(zhì)或其功能性片段，而且所述同工型I蛋白質(zhì)以可檢測(cè)的量存在于人的樣品中，所述人經(jīng)2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1Η-吡唑-5-基]氨基}_4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺與其它抗癌劑組合治療，而且所述方法還包括加強(qiáng)對(duì)癌癥的監(jiān)測(cè)。
[0031]在另一實(shí)施方案中，從需要治療癌癥的人獲得的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的NF2的同工型I基因產(chǎn)物用作生物標(biāo)記，其中在所述樣品中不存在可檢測(cè)量的NF2同工型I表明所述人適用于用FAK抑制劑治療。在另一實(shí)施方案中，從需要治療癌癥的人獲得的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的NF2的同工型I基因產(chǎn)物用作生物標(biāo)記，其中所述基因產(chǎn)物為蛋白質(zhì)，且其中所述樣品中不存在可檢測(cè)量的神經(jīng)纖維瘤蛋白2同工型I蛋白質(zhì)表明所述人適用于FAK抑制劑治療。在另一實(shí)施方案中，從需要治療癌癥的人獲得的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的NF2的同工型I基因產(chǎn)物如神經(jīng)纖維瘤蛋白2同工型I蛋白質(zhì)用作生物標(biāo)記，其中所述樣品中不存在可檢測(cè)量的神經(jīng)纖維瘤蛋白2同工型I蛋白質(zhì)表明所述人適用于用FAK抑制劑治療，其中所述FAK抑制劑為2-[(5-氯-2-{[3-甲基_1_(1_甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺，且其中所述癌癥治療是針對(duì)間皮瘤的。
[0032]Merlin 同工型 I
[0033]NF2基因的蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物常被稱為merlin (UniProt N0.P35240)，也被稱為神經(jīng)纖維瘤蛋白_2。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)merlin同工型I蛋白質(zhì)與神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I蛋白質(zhì)和NF2同工型I蛋白質(zhì)相同。本領(lǐng)域已知所述NF2的同工型I蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物，或merlin同工型I蛋白質(zhì)具有腫瘤抑制功能。Merlin同工型I蛋白質(zhì)可被簡(jiǎn)寫為merlin ;而merlin指的是merlin同工型I或多種同工型根據(jù)上下文應(yīng)當(dāng)是清楚的。本文中，不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)被稱為“merlin陰性”。本文中，如果在癌或腫瘤中，或至少在一部分癌細(xì)胞中，例如一部分從需要治療癌癥的人獲得的作為樣品的癌細(xì)胞中，不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)，則所述癌為“merlin陰性癌”。本文中，不存在可檢測(cè)量的功能性merlin同工型I蛋白質(zhì)的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)同樣被稱為merlin陰性。本文中，如果在癌或腫瘤中，或在至少一部分癌細(xì)胞中，例如一部分從需要治療癌癥的人獲得的作為樣品的癌細(xì)胞中，不存在可檢測(cè)量的功能性merlin同工型I蛋白質(zhì)，則所述癌也為merlin陰性癌。
[0034]如上所述，可由NF2基因中的突變導(dǎo)致不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)?？捎僧惓＾D(zhuǎn)錄或翻譯，或多種轉(zhuǎn)錄后或翻譯后加工(正常的和異常的)導(dǎo)致不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)?？捎蓡?dòng)子或merlin同工型ImRNA轉(zhuǎn)錄必需的其它調(diào)節(jié)序列中的突變導(dǎo)致不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)。此外，可由于多種表觀遺傳現(xiàn)象導(dǎo)致不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)；例如，可通過(guò)表觀遺傳機(jī)制抑制merlin同工型I蛋白質(zhì)。不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)可能是遺傳修飾的結(jié)果，所述遺傳修飾包括但不限于，在一個(gè)或多個(gè)其它基因中的交替、突變、缺失、插入等，所述其它基因不是NF2基因但是merlin表達(dá)(例如，merlin同工型ImRNA或蛋白質(zhì)表達(dá))所需要的，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性所需要的因子。
[0035]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，merlin同工型I蛋白質(zhì)可以可檢測(cè)量存在，但是所述merlin同工型I蛋白質(zhì)不是功能性的。不存在可檢測(cè)量的功能性merlin同工型I蛋白質(zhì)可能由于多種原因如突變、異常轉(zhuǎn)錄或翻譯、或異常的轉(zhuǎn)錄后或翻譯后加工發(fā)生。具有功能缺失的merlin同工型I蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞將可能與具有不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞顯不相同的表型；例如，與患有具有功能性merlin同工型I蛋白質(zhì)的癌癥的人相比，該表型將允許在具有所述癌細(xì)胞的人中使用本文公開(kāi)的FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽改善治療。該表型也可包括升高水平的pFAK表達(dá)。
[0036]本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠建立功能缺失的merlin同工型I蛋白質(zhì)，包括但不限于通過(guò)merlin蛋白測(cè)量下游信號(hào)傳導(dǎo)。下游信號(hào)傳導(dǎo)的一種此類通路是涉及MST1/2和LATS1/2激酶的規(guī)范通路(canonical pathway),其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子YAP/TAZ。測(cè)量所述下游信號(hào)傳導(dǎo)任選包括測(cè)定測(cè)定所述激酶(例如MST1/2和/或LAT1/2)的靶點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)和/或磷酸化水平。測(cè)量所述下游信號(hào)傳導(dǎo)任選包括測(cè)量YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的靶基因的表達(dá)水平。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠測(cè)量與merlin有關(guān)的激酶通路的下游信號(hào)傳導(dǎo)。
[0037]本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案為在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括測(cè)定從所述人獲得的腫瘤樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)或其功能性片段，并且如果未檢測(cè)到merlin同工型I蛋白質(zhì)或其功能性片段，則向所述人給藥有效量的2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1Η-吡唑-5-基]氨基}_4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0038]另一實(shí)施方案為治療在有需要的人中merlin陰性癌癥的方法，其包括向所述人給藥治療有效量的FAK抑制劑。在另一項(xiàng)治療人中merlin陰性癌癥的方法的實(shí)施方案中，所述FAK抑制劑為2- [ (5-氯-2- {[3-甲基-1- (1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基} -4-吡啶基)氨基]-N_(甲基氧基)苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0039]在另一實(shí)施方案中，在從需要治療癌癥的人獲得的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)或其功能性片段用作生物標(biāo)記，其中所述樣品中不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)或其功能性片段表明所述人適用于用FAK抑制劑治療。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，在從需要治療癌癥的人獲得的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)或其功能性片段用作生物標(biāo)記，其中所述樣品中不存在可檢測(cè)量的merlin同工型I蛋白質(zhì)或其功能性片段表明所述人適用于用FAK抑制劑治療，其中所述FAK抑制劑為2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1Η-吡唑-5-基]氨基}_4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺，且其中所述癌癥治療是針對(duì)間皮瘤的。
[0040]pFAK
[0041]磷酸化的FAK或pFAK，可在具有一個(gè)或多個(gè)NF2突變的細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。例如，PFAK在一些具有NF2基因突變的腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，其中所述NF2基因突變導(dǎo)致NF2基因的同工型I蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物的表達(dá)不足。因此，在一些實(shí)施方案中，pFAK以更高的量存在于腫瘤細(xì)胞中，其中不存在可檢測(cè)量的神經(jīng)纖維瘤蛋白2同工型I蛋白質(zhì)或merlin同工型I蛋白質(zhì)。(如本領(lǐng)域已知和本文所述，神經(jīng)纖維瘤蛋白2同工型I蛋白質(zhì)與merlin同工型I蛋白質(zhì)有相同的氨基酸序列，而且各自還可被稱為其它名稱，如NF2同工型I蛋白質(zhì))。
[0042]在本文治療癌癥的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括測(cè)定從有需要的人獲得的樣品中PFAK的水平，并且與對(duì)照樣品相比，如果測(cè)定的pFAK水平升高，則向所述人給藥有效量的FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一實(shí)施方案中，所述對(duì)照樣品是從正常患者組織中制得的。在另一實(shí)施方案中，所述對(duì)照樣品是從包含野生型NF2基因的細(xì)胞中制得的。在另一實(shí)施方案中，使用多個(gè)對(duì)照樣品。
[0043]在本文另一治療癌癥的方法的實(shí)施方案中，測(cè)定不存在或存在可檢測(cè)量的NF2同工型I并測(cè)定PFAK的水平。在另一實(shí)施方案中，如果觀察到pFAK升高且未觀察到可檢測(cè)量的NF2同工型1，則給藥FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一治療癌癥的方法的實(shí)施方案中，所述方法包括測(cè)定PFAK水平，所述癌癥為間皮瘤，且如果給藥，則所述FAK抑制劑為式I的FAK抑制劑，優(yōu)選化合物A。
[0044]存在或不存在可檢測(cè)量的基因產(chǎn)物
[0045]檢測(cè)存在或不存在NF2的基因產(chǎn)物(例如同工型I)意味著建立可能在樣品中表達(dá)的基因產(chǎn)物(例如NF2同工型I蛋白質(zhì)、神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I蛋白質(zhì)，或merlin同工型I蛋白質(zhì))，并且例如，其可在用于檢測(cè)的任何特定分析的背景噪音之上的水平檢測(cè)到。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通曉從低信號(hào)或背景信號(hào)區(qū)分表明基因產(chǎn)物表達(dá)或存在的正信號(hào)?？蓪?shí)施陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照以確立與正信號(hào)區(qū)別的背景或噪音。例如，“減除(cutoff) ”可通過(guò)在不表達(dá)感興趣的基因產(chǎn)物的陰性對(duì)照中測(cè)定背景噪音如染色或其它測(cè)量信號(hào)的水平來(lái)確立。因此，存在基因產(chǎn)物意味著在組織中例如一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中或組織內(nèi)的部分細(xì)胞中，所述基因產(chǎn)物在背景水平之上可檢測(cè)到。相反，不存在基因產(chǎn)物意味著在組織中例如一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中或組織內(nèi)的部分細(xì)胞中，所述基因產(chǎn)物在背景水平之上不可測(cè)量。
[0046]不存在或存在可檢測(cè)量的基因產(chǎn)物(其中所述基因產(chǎn)物為蛋白質(zhì))，可通過(guò)多種本領(lǐng)域公知的任何方法完成檢測(cè)。這些方法包括但不限于以下的一種或多種:質(zhì)譜、2D、電泳、HPLC、蛋白質(zhì)測(cè)序和多種免疫學(xué)檢測(cè)方法。所述免疫學(xué)檢測(cè)方法包括但不限于免疫親和性分析、免疫沉淀分 析、免疫細(xì)胞化學(xué)分析、ELISA、固相夾心分析、免疫印跡、高通量免疫印跡、免疫組織化學(xué)，或這些技術(shù)的組合。
[0047]免疫組織化學(xué)
[0048]優(yōu)選地，在本文一項(xiàng)實(shí)施方案中，存在或不存在可檢測(cè)量的NF2基因的同工型I基因產(chǎn)物通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)測(cè)定。在另一項(xiàng)其中蛋白質(zhì)被檢測(cè)的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)為神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I。在另一項(xiàng)治療癌癥的實(shí)施方案中，其中蛋白質(zhì)被檢測(cè)，不存在或存在可檢測(cè)量的神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I蛋白質(zhì)通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)測(cè)定。
[0049]IHC是使用一種或多種對(duì)蛋白質(zhì)特異性的抗體檢測(cè)組織樣品如腫瘤活檢樣品中的所述蛋白質(zhì)的方法。(在這種意義上，抗體特定檢測(cè)的蛋白質(zhì)常被稱作抗原)。所述抗體與所述蛋白質(zhì)的結(jié)合通過(guò)染色和顯微術(shù)分辨。IHC是本領(lǐng)域所公知的。
[0050]通常，獲得的組織樣品必須迅速保存以避免細(xì)胞蛋白質(zhì)和組織結(jié)構(gòu)的分解。常常，在保存前，所述組織經(jīng)血液灌注或沖洗。用于IHC的組織樣品的制備方法也是本領(lǐng)域所公知的，其包括但不限于，石蠟包埋、快速冷凍、福爾馬林固定和甲醛固定。
[0051]制備的組織，如石蠟包埋的組織，通常使用切片機(jī)切成4-5^厚度的薄片。然后將這些切片固定在涂布有粘合劑的玻片上。這些粘合劑通常通過(guò)表面經(jīng)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)或聚-L-賴氨酸處理的玻片添加。玻片可另外地經(jīng)其它適宜的粘合劑包括明膠、卵白蛋白或市場(chǎng)上可得的膠水涂布。固定后，干燥所述切片。石蠟包埋的玻片可在烘箱或微波爐中干燥以去石臘化。
[0052]冷凍切片可使用預(yù)冷卻的恒冷切片機(jī)制備并固定在粘性的玻片上。這些切片通常在室溫干燥過(guò)夜并通過(guò)浸沒(méi)在預(yù)冷卻的(_20°C )丙酮中固定，盡管基于待檢測(cè)的組織和蛋白質(zhì)，所述干燥步驟可根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員決定而省略。
[0053]在染色和檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)存在或不存在前，所述組織樣品是“暴露的”，以使抗體接觸所述蛋白質(zhì)。該過(guò)程常稱為抗原修復(fù)，且可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種手段如加熱或酶促手段(包括使用胰蛋白酶、胃蛋白酶，或其它蛋白酶)完成。
[0054]所述抗體與樣品中蛋白質(zhì)的結(jié)合可通過(guò)與所述抗體在多種本領(lǐng)域公知的溶液或緩沖液中溫育完成。緩沖液可含有阻斷劑，其阻斷所述抗體對(duì)組織的非特異性結(jié)合；阻斷可在組織樣品玻片和抗體溫育前或溫育過(guò)程中完成。所述方法中使用的抗體的量可影響隨后通過(guò)顯微術(shù)分辨的信號(hào)的水平，而且本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉例如通過(guò)測(cè)試所述抗體的稀釋液來(lái)測(cè)定和優(yōu)化用于特定IHC分析中的抗體的量。
[0055]通常，IHC中使用的抗體可以為單克隆抗體或多克隆抗體。在檢測(cè)神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I的情況中，所述抗體必須能夠檢測(cè)其它同工型可能存在的組織中存在或不存在同工型I蛋白質(zhì)。所以，必須使用神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I特異性抗體。所述特異性抗體經(jīng)常為單克隆抗體；然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠識(shí)別適于檢測(cè)樣品中存在或不存在NF2同工型I的多克隆抗體制劑。優(yōu)選地，在本文的一項(xiàng)實(shí)施方案中，存在或不存在NF2基因的同工型I蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物的檢測(cè)包括:使樣品接觸針對(duì)神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I的單克隆抗體，其中該抗體能夠可檢測(cè)地結(jié)合神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型1，并且不會(huì)可檢測(cè)地結(jié)合其他神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述抗神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I單克隆抗體不會(huì)可檢測(cè)地結(jié)合NF2的同工型2蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述抗體為多克隆抗體制劑，其中所述多克隆抗體能夠結(jié)合神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I蛋白質(zhì)，而不結(jié)合神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型2蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，其中所述單克隆抗體或所述多克隆抗體可檢測(cè)地結(jié)合神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型I但不會(huì)可檢測(cè)地結(jié)合神經(jīng)纖維瘤蛋白-2同工型2，所述單克隆抗體或所述多克隆抗體也不會(huì)可檢測(cè)地結(jié)合除同工型I外的其它同工型。
[0056]抗體結(jié)合蛋白質(zhì)的檢測(cè)可通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法完成，所述方法如標(biāo)記有熒光團(tuán)(fluorofore)的抗體的免疫熒光檢測(cè)或與免疫過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗體的免疫過(guò)氧化物酶染色。本領(lǐng)域公知的其它檢測(cè)方法包括顯色檢測(cè)、放射性、化學(xué)發(fā)光，以及其它生物的和酶的標(biāo)記或標(biāo)簽。也可使用間接檢測(cè)，且可具有優(yōu)點(diǎn)，如基于生物素/抗生物素蛋白的系統(tǒng)和其它在本領(lǐng)域的知識(shí)和技能內(nèi)的二次檢測(cè)系統(tǒng)(secondary detection systems)。
[0057]本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可使用對(duì)比染色以使細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室，如細(xì)胞核可視化。
[0058]基因檢測(cè)
[0059]NF2基因突變也可在基因水平上，單獨(dú)測(cè)定或與測(cè)定存在或不存在基因產(chǎn)物如蛋白質(zhì)組合測(cè)定。這樣的基因測(cè)試可通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種手段完成，所述手段包括但不限于，測(cè)序、RT-PCR，和原位雜交，如基于熒光的原位雜交(FISH)。
[0060]根據(jù)本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案，在有需要的人中治療癌癥的方法包括檢測(cè)在從所述人獲得的樣品中NF2基因中的突變，測(cè)定所述NF2基因中的突變是否導(dǎo)致NF2同工型I的表達(dá)不足，并且如果所述突變導(dǎo)致NF2同工型I的表達(dá)不足，則向所述人給藥治療有效量的FAK抑制劑，如本文的化合物A，或其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，測(cè)定所述NF2基因中的突變是否導(dǎo)致NF2同工型I的表達(dá)不足包括進(jìn)行選自以下的方法:測(cè)序、RT-PCR和FISH。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，測(cè)定所述NF2基因中的突變是否導(dǎo)致NF2同工型I的表達(dá)不足包括進(jìn)行選自以下的方法:測(cè)序、RT-PCR和FISH。測(cè)序、RT-PCR和FISH允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員建立NF2基因中的染色體丟失或其它缺失，所述染色體丟失或其它缺失會(huì)導(dǎo)致NF2基因產(chǎn)物(尤其是同工型I蛋白質(zhì))的表達(dá)不足。測(cè)序和RT-PCR允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員建立點(diǎn)突變、插入或缺失，所述點(diǎn)突變、插入或缺失會(huì)導(dǎo)致未成熟終止密碼子和導(dǎo)致NF2基因產(chǎn)物(尤其是同工型I蛋白質(zhì))的表達(dá)不足。
[0061]根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，測(cè)定患者是否在給定基因處具有會(huì)響應(yīng)FAK抑制劑的具體突變包括:
[0062]a.在從受治療者腫瘤獲得的生物學(xué)樣品上進(jìn)行基因分型技術(shù)以測(cè)定所述患者是否具有攜帶至少一個(gè)NF2同工型突變體的腫瘤。
[0063]b.使所述突變的檢測(cè)與以下的可能性增加相關(guān)(與如果所述突變未檢測(cè)的可能性相比):當(dāng)給藥FAK抑制劑，任選式I的FAK抑制劑，任選化合物A時(shí)，經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)增加的響應(yīng)率、更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期或更長(zhǎng)的總生存期的一種或多種。
[0064]FAK抑制劑
[0065]在本文任何治療癌癥例如merlin陰性癌癥或檢測(cè)不到神經(jīng)纖維瘤蛋白_2同工型I蛋白質(zhì)的癌癥的方法中，F(xiàn)AK抑制劑可為式(I)的化合物或其鹽:
【權(quán)利要求】
1.在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括測(cè)定所述人的樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的神經(jīng)纖維瘤蛋白-2(NF2)基因的基因產(chǎn)物，并且如果未檢測(cè)到基因產(chǎn)物或同工型I基因產(chǎn)物，則向所述人給藥有效量的粘著斑激酶(FAK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.權(quán)利要求1的方法,其還包括檢測(cè)磷酸化的FAK(p-FAK)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其還包括如果NF2基因的同工型I基因產(chǎn)物存在，則檢測(cè)NF2的同工型I基因產(chǎn)物的功能的缺失。
4.權(quán)利要求3的方法，其還包括如果可檢測(cè)量的NF2基因的同工型I基因產(chǎn)物存在且檢測(cè)到NF2基因的同工型I基因產(chǎn)物的功能缺失，則向所述人給藥有效量的FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中使用免疫組織化學(xué)(IHC)測(cè)定存在或不存在NF2基因的基因產(chǎn)物或同工型I基因產(chǎn)物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中IHC包括使用結(jié)合NF2基因的同工型I基因產(chǎn)物但不結(jié)合NF2基因的其它同工型基因產(chǎn)物的抗體。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述使用FAK抑制劑的治療導(dǎo)致無(wú)進(jìn)展生存(PFS)時(shí)間增加。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述PFS時(shí)間的增加是有臨床意義的。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述PFS時(shí)間的增加是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
10.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包含一個(gè)或多個(gè)腫瘤細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述NF2基因的基因產(chǎn)物為蛋白質(zhì)或其功能性片段。
12.在有需要的人中治療癌癥的方法，其包括括測(cè)定所述人的腫瘤樣品中存在或不存在可檢測(cè)量的merlin或其功能性片段，并且如果未檢測(cè)到merlin或其功能性片段，則向所述人給藥有效量的2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。
13.在有需要的人中治療merlin陰性癌癥的方法，其包括向所述人給藥治療有效量的FAK抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法，其中所述FAK抑制劑為2-[(5_氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥選自神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、室管膜瘤、間皮瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑素瘤、甲狀腺癌、膀胱癌、皮膚癌、胃癌、骨癌、腎癌、乳腺癌和腸癌。
16.權(quán)利要求17的方法，其中所述癌癥為間皮瘤。
【文檔編號(hào)】A61K38/00GK103930114SQ201280042271
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月28日
【發(fā)明者】K.R.奧格, M.M.達(dá), R.A.弗萊明 申請(qǐng)人:葛蘭素史密斯克萊知識(shí)產(chǎn)權(quán)（第2號(hào)）有限公司