本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋方法。

背景技術(shù)：

高通量rna測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)代基因組學(xué)研究最重要的技術(shù)手段，在整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。隨著測(cè)序數(shù)據(jù)的大量積累，基因組學(xué)研究得到快速發(fā)展。在利用高通量rna測(cè)序技術(shù)運(yùn)用于差異表達(dá)基因即編碼rna的研究基礎(chǔ)上，越來越多的研究關(guān)注到基因組的非編碼rna上。這些非編碼rna包括mirnas、sirnas、lncrnas、circularrna等，其中mirnas由于其具有獨(dú)特二級(jí)結(jié)構(gòu)以及與靶基因的作用方式已經(jīng)廣泛地被證明在植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面具有重要作用。而lncrnas是一類長度超過200nt，不具有蛋白編碼能力的非編碼rna，其不具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以通過多種方式影響靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。因此，高通量的開展lncrnas的功能注釋工作對(duì)于今后的非編碼rna的功能研究具有重要意義。

目前，已有的研究主要通過計(jì)算非編碼rna與編碼rna共表達(dá)關(guān)系的方法將lncrnas與共表達(dá)的mrna分為一組，利用mrna的注釋信息來完成lncrnas的功能注釋。該方法不僅需要大量的表達(dá)數(shù)據(jù)用于共表達(dá)分析，同時(shí)將缺失脅迫響應(yīng)特異表達(dá)lncrnas的功能注釋信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供了一種植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋方法，包括以下步驟：

步驟s1，篩選植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas；

步驟s2，篩選對(duì)植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas的候選靶基因；

步驟s3，植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas的靶基因的功能注釋；

步驟s4，對(duì)響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)富集分析；

步驟s5，逆境脅迫響應(yīng)lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋方法中，所述步驟s1中所述逆境脅迫為低溫處理或高鹽處理；優(yōu)選地，所述低溫處理為4℃處理6小時(shí)；所述高鹽處理為150mmnacl處理6小時(shí)。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋方法中，所述步驟s1中l(wèi)ncrnas篩選標(biāo)準(zhǔn)為①長度大于200nt；②最小讀長覆蓋率為5；③開放閱讀框小于300nt；④利用cpc分析、cnci分析編碼蛋白能力(閾值為cpcscore<0,cnciscore<0)。⑤利用cuffdiff進(jìn)行l(wèi)ncrnas差異表達(dá)分析(最小閾值為：差異倍數(shù)>2或<0.5，p-值<0.05，q-值<0.05)。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋方法中，所述步驟s2中對(duì)順式作用靶基因篩選規(guī)則為在篩選對(duì)逆境脅迫響應(yīng)lncrnas的上下游10kb范圍內(nèi)的基因；對(duì)反式作用靶基因篩選規(guī)則為①利用blast進(jìn)行序列互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e-value＝1e-10,identity＝90％。②利用rnaplex進(jìn)行熱力學(xué)上的互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e＝-70。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋方法中，所述步驟s3中對(duì)植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas的靶基因的功能注釋的方法為：利用ncbi核酸數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行功能注釋；利用agrigo(http://bioinfo.cau.edu.cn/agrigo/)對(duì)候選基因goterm進(jìn)行富集分析。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋方法中，所述步驟s4中對(duì)響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)富集分析方法為利用rnamotif2008對(duì)脅迫響應(yīng)的lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行富集分析。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋方法中，所述分析中篩選的參數(shù)設(shè)置為：①預(yù)測(cè)motif數(shù)量4-6個(gè)；②stem數(shù)量4-6；③loop數(shù)量1-3個(gè)④分布模式為一般模式(normal)。共獲得富集的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)4個(gè)。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的植物響應(yīng)逆境脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋方法中，所述步驟s5中逆境脅迫響應(yīng)lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)方法為根據(jù)脅迫響應(yīng)lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)富集結(jié)構(gòu)及l(fā)ncrnas靶基因的功能注釋結(jié)果，對(duì)lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

本發(fā)明還提供了上述方法在響應(yīng)逆境脅迫的植物lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋與預(yù)測(cè)中的用途。

即本發(fā)明提供一種響應(yīng)逆境脅迫的植物lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋的方法，結(jié)合生物信息學(xué)與差異表達(dá)分析對(duì)植物逆境脅迫響應(yīng)lncrnas的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行注釋，不但極大地提高了實(shí)驗(yàn)的效率、精準(zhǔn)性以及靈活性并顯著地降低了實(shí)驗(yàn)成本。

附圖說明

圖1為植物lncrnas響應(yīng)逆境脅迫的二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋的方法流程示意圖；圖2毛白楊響應(yīng)高溫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋結(jié)果；

圖3小葉楊響應(yīng)滲透脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋結(jié)果。

具體實(shí)施方式

根據(jù)本發(fā)明一個(gè)典型的實(shí)施方式，待測(cè)樣本為小葉楊1年生植株。對(duì)其進(jìn)行高溫(42℃,6小時(shí))處理，立即采取葉片用于提取總rnas。利用ribo-zerorrna試劑盒對(duì)核糖體rna進(jìn)行去除。利用smart試劑盒進(jìn)行鏈特異性cdna文庫構(gòu)建。利用illuminahiseq^tm2500測(cè)序平臺(tái)完成cdna文庫測(cè)序，測(cè)序深度為10×。去除接頭以及冗余序列，通過cufflinks軟件拼接轉(zhuǎn)錄本，篩選長度大于200nt、最小讀長覆蓋率為5、cpcscore<0、cnciscore<0以及與對(duì)照差異表達(dá)倍數(shù)大于2(p<0.05)的lncrnas。預(yù)測(cè)差異表達(dá)的lncrnas順式及反式作用靶基因，并對(duì)靶基因的表達(dá)模式進(jìn)行解析，篩選差異表達(dá)的靶基因作為候選基因(最小閾值為：差異倍數(shù)>2或<0.5,p-值<0.05,q-值<0.05)。對(duì)于候選基因，利用ncbi核酸數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行功能注釋。利用agrigo(http://bioinfo.cau.edu.cn/agrigo/)對(duì)候選基因goterm進(jìn)行富集分析。利用rnamotif2008(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/rnamotifs08/rnamotifs08_predict.html#)對(duì)脅迫響應(yīng)的lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行富集分析。根據(jù)脅迫響應(yīng)的lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)富集結(jié)構(gòu)及l(fā)ncrnas靶基因的功能注釋結(jié)果，對(duì)lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說明，應(yīng)理解以下僅為本發(fā)明的示例性說明，并不用于限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

對(duì)毛白楊1年生植株進(jìn)行高溫(42℃,6小時(shí))處理，提取其總rna用于響應(yīng)高溫脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)功能注釋。

s1，利用ribo-zerorrna試劑盒對(duì)核糖體rna進(jìn)行去除。利用smart試劑盒進(jìn)行鏈特異性cdna文庫構(gòu)建。利用illuminahiseqtm2500測(cè)序平臺(tái)完成cdna文庫測(cè)序，測(cè)序深度為10×。去除接頭以及冗余序列，通過cufflinks軟件拼接轉(zhuǎn)錄本，篩選長度大于200nt、最小讀長覆蓋率為5、cpcscore<0、cnciscore<0lncrnas，共獲得3631個(gè)。篩選差異倍數(shù)大于10且小于20(p-值<0.05,q-值<0.05)的lncrnas，共16個(gè)(見表1)。

表1毛白楊響應(yīng)高溫逆境脅迫的lncrnas

s2，在14個(gè)響應(yīng)高溫脅迫的lncrna上下游各10kb范圍內(nèi)篩選順式作用靶基因，共獲得31個(gè)(見表2)。利用blast進(jìn)行序列互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e-value＝1e-10，identity＝90％以及利用rnaplex進(jìn)行熱力學(xué)上的互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e＝-70。共獲得反式作用靶基因30個(gè)(見表3)。根據(jù)差異表達(dá)靶基因篩選標(biāo)準(zhǔn)(p-值<0.05,q-值<0.05)篩選獲得候選靶基因42個(gè)(見表4)。

表2毛白楊響應(yīng)低溫逆境脅迫的lncrnas順式作用靶基因

表3毛白楊響應(yīng)高溫逆境脅迫的lncrnas反式作用靶基因

表4毛白楊響應(yīng)高溫逆境脅迫的lncrnas靶基因功能注釋

s3，對(duì)于候選基因，利用ncbi核酸數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行功能注釋(見表4)。利用agrigo(http://bioinfo.cau.edu.cn/agrigo/)對(duì)候選基因goterm進(jìn)行富集分析(見表5)。

表5毛白楊響應(yīng)高溫逆境脅迫的lncrnas靶基因功能富集分析

s4,利用rnamotif2008(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/rnamotifs08/rnamotifs08_predict.html#)對(duì)脅迫響應(yīng)的lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行富集分析。篩選參數(shù)設(shè)置如下：①預(yù)測(cè)motif數(shù)量4-6個(gè)；②stem數(shù)量4-6；③loop數(shù)量1-3個(gè)④分布模式為一般模式(normal)。共獲得富集的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)4個(gè)(見圖2)。

s5，利用lncrnas靶基因的功能注釋結(jié)果，對(duì)lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)(見圖2)。

如圖2所示，結(jié)構(gòu)序列1,go：go:0019725細(xì)胞自動(dòng)調(diào)節(jié)；

結(jié)構(gòu)序列2：go:0042592穩(wěn)定作用；

結(jié)構(gòu)序列3：go:0045454，細(xì)胞氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)；

結(jié)構(gòu)序列4：go:0065008，生物質(zhì)量的監(jiān)管。

實(shí)施例2

對(duì)1年生小葉楊植株進(jìn)行滲透脅迫處理(30％聚乙二醇6000，6小時(shí))，提取其總rna用于對(duì)響應(yīng)滲透脅迫的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)的功能注釋。

s1，利用ribo-zerorrna試劑盒對(duì)核糖體rna進(jìn)行去除。利用smart試劑盒進(jìn)行鏈特異性cdna文庫構(gòu)建。利用illuminahiseqtm2500測(cè)序平臺(tái)完成cdna文庫測(cè)序，測(cè)序深度為10×。去除接頭以及冗余序列，通過cufflinks軟件拼接轉(zhuǎn)錄本，篩選長度大于200nt、最小讀長覆蓋率為5、cpcscore<0、cnciscore<0lncrnas，共獲得7360個(gè)。篩選差異倍數(shù)大于0.03且小于0.2(p-值<0.05,q-值<0.05)條件下共19個(gè)lncrnas。(見表6)。

表6小葉楊響應(yīng)滲透逆境脅迫lncrnas

s2，在19個(gè)響應(yīng)高溫脅迫的lncrna上下游10kb范圍內(nèi)篩選順式作用靶基因，共獲得53個(gè)(見表7)。利用blast進(jìn)行序列互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e-value＝1e-10，identity＝90％以及利用rnaplex進(jìn)行熱力學(xué)上的互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e＝-70。共獲得反式作用靶基因71個(gè)(見表8)。根據(jù)差異表達(dá)靶基因篩選標(biāo)準(zhǔn)(p-值<0.05,q-值<0.05)篩選獲得候選靶基因102個(gè)(見表9)

表7小葉楊響應(yīng)滲透逆境脅迫的lncrnas順式作用靶基因

表8小葉楊響應(yīng)滲透逆境脅迫的lncrnas反式作用靶基因

表9小葉楊響應(yīng)滲透逆境脅迫的lncrnas靶基因功能注釋

s3，對(duì)于候選基因，利用ncbi核酸數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行功能注釋(見表9)。利用agrigo(http://bioinfo.cau.edu.cn/agrigo/)對(duì)候選基因goterm進(jìn)行富集分析(見表10)。

表10小葉楊響應(yīng)滲透逆境脅迫的lncrnas靶基因功能富集分析

s4,利用rnamotif2008(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/rnamotifs08/rnamotifs08_predict.html#)對(duì)響應(yīng)脅迫的lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行富集分析。篩選參數(shù)設(shè)置如下：①預(yù)測(cè)motif數(shù)量4-6個(gè)；②stem數(shù)量4-6；③loop數(shù)量1-3個(gè)④分布模式為一般模式(normal)。共獲得富集的lncrnas二級(jí)結(jié)構(gòu)3個(gè)(見圖3)

s5，利用lncrnas靶基因的功能注釋結(jié)果，對(duì)lncrnas特異二級(jí)結(jié)構(gòu)的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)(見圖3)。

如圖3所示，結(jié)構(gòu)序列1,go:0006979，抗氧化作用；

結(jié)構(gòu)序列2：go:0016310，磷酸化作用；

結(jié)構(gòu)序列3：go:0005509，鈣離子綁定。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。