專利名稱：雞綠殼蛋基因的克隆及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域和雞育種領(lǐng)域，尤其涉及一種雞綠殼蛋基因的克隆及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋殼顏色是衡量雞蛋品質(zhì)的指標(biāo)之一，因此培育蛋殼顏色美觀、色澤均一、遺傳穩(wěn)定的品種一直都是家禽育種的目標(biāo)之一。綠殼蛋以其獨(dú)特的蛋殼顏色和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值一直都深受消費(fèi)者喜愛。它在禽蛋市場(chǎng)常以營(yíng)養(yǎng)品、保健品的形式出售，價(jià)格也較常見的白殼蛋、褐殼蛋、粉殼蛋高，具有良好的市場(chǎng)前景。雞綠殼蛋性狀是由顯性單基因(0)控制的質(zhì)量性狀，即綠殼蛋雞(0/0)與非綠殼蛋雞(ο/ο)雜交，后代(Ο/ο)總是下綠殼蛋。這種遺傳特點(diǎn)也決定了按照表型選育綠殼蛋雞很難將隱性等位基因ο從綠殼群體中徹底淘汰，使得綠殼蛋雞育種總是面臨選而不純的尷尬局面。常規(guī)育種手段只能通過測(cè)交來鑒定雜合子，以淘汰隱性基因O。但這種方法費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng)，在生產(chǎn)中很難大規(guī)模應(yīng)用。采用一些和綠殼性狀顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，可以在一定程度上提高選種的準(zhǔn)確性，但準(zhǔn)確性無(wú)法達(dá)到100%。因此，只有克隆 0基因，才能徹底解決上述綠殼蛋雞育種中存在的問題。綠殼蛋的主要蛋殼色素是膽綠素，但也含有一定數(shù)量的原卟啉和膽綠素鋅螯合物。這些色素由雞的蛋殼腺(輸卵管子宮部)分泌到蛋殼上。研究表明蛋殼中的膽綠素與膽汁膽綠素屬同一種物質(zhì)，均由血紅素分解而來。因此0的性質(zhì)最有可能與膽綠素的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞是否為綠殼蛋雞的方法，也就是預(yù)測(cè)待測(cè)雞是否產(chǎn)綠殼蛋的方法，以及鑒定待測(cè)雞是否為綠殼蛋雞純合子的方法。本發(fā)明提供的方法為檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA，若基因組DNA中含有目的DNA分子，則所述待測(cè)雞為或候選為綠殼蛋雞；若基因組DNA中不含有目的DNA分子，則所述待測(cè)雞不為或候選不為綠殼蛋雞；所述目的DNA分子為如下1) -3)中的任意一種1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述DNA分子中的嚴(yán)格條件具體可以為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C 下雜交，然后用2X SSC, 0. 1% SDS和1XSSC，0. 1% SDS各洗膜一次。該方法中，上述目的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列1(即為序列2中自5，末端第909-5107位)。該方法中，上述目的DNA分子在雞基因組DNA的位置為SLC01B3基因的上游，上述目的DNA分子在所述雞基因組DNA的位置具體為在雞基因組(UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)，雞基因組2006 年5月裝配)的第一號(hào)染色體的第673M641-67324642位間；該SLC01B3基因的核苷酸序列為序列表中的序列6，其位于雞基因組的第一號(hào)染色體上的673沘451-67；343147位間。該方法中，上述檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA的方法可以為直接測(cè)序，也可以根據(jù)目的DNA分子設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，或根據(jù)目的DNA分子設(shè)計(jì)探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)；該方法中，上述待測(cè)雞的基因組DNA來源于離體的雞組織器官或血液，本發(fā)明的實(shí)施例中為靜脈采血。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞是否為綠殼蛋雞的方法。本發(fā)明提供的方法為檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA，用引物序列4和引物序列5擴(kuò)增待測(cè)雞的基因組DNA，若PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度含有61Λ片段，則所述待測(cè)雞為或候選為綠殼蛋雞；若 PCR產(chǎn)物中不含有61Λ的片段，則所述待測(cè)雞不為或候選不為綠殼蛋雞；所述61Λ的片段的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA的方法為測(cè)序、PCR或分子雜交；所述待測(cè)雞的基因組DNA具體來源于離體的雞組織器官或血液。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞的基因型方法。本發(fā)明提供的方法為檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA，若所述基因組DNA中含有61Λ片段或所述目的DNA分子，則所述待測(cè)雞的基因型為或候選為0/0純合型或Ο/ο雜合型；若基因組DNA中不含有61Λ的片段或所述目的DNA分子，則所述待測(cè)雞不為或候選不為0/0純合型或Ο/ο雜合型；所述61Λ的片段的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；上述方法中，所述目的DNA分子的片段)的核苷酸序列為序列表中的序列1 ； 所述61Λ的片段的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；該方法中，上述檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA的方法可以為直接測(cè)序，也可以根據(jù)6Kb 的片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)大小，或根據(jù)目的DNA分子設(shè)計(jì)探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)；上述方法中，待測(cè)雞的基因組DNA具體來源于離體的雞組織器官或血液，本發(fā)明的實(shí)施例中為靜脈采血。上述鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞的基因型方法在鑒定待測(cè)雞是否為綠殼蛋雞中的應(yīng)用該應(yīng)用中，所述應(yīng)用為若所述待測(cè)雞的基因型為0/0純合型或Ο/ο雜合型任意一種，則所述待測(cè)雞為綠殼蛋雞；若所述待測(cè)雞的基因型不為0/0純合型或Ο/ο雜合型中的任意一種，則所述待測(cè)雞不為綠殼蛋雞。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種DNA分子。本發(fā)明提供的DNA分子，為如下1) -4)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)序列表中的序列2所示的DNA分子；
3)在嚴(yán)格條件下可與1)或2)限定的DNA序列雜交的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有70%以上的同源性的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C條件下雜交并洗膜。其中，序列1為序列2中自5，末端第909-5107位。含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種擴(kuò)增上述DNA分子的引物對(duì)。本發(fā)明提供的引物對(duì)具體由序列表中的序列4所示的一條引物和序列表中的序列5所示的另一條引物組成。含有上述的引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；其中，上述PCR試劑由上述的引物對(duì)、dNTP、DNA聚合酶和PCR緩沖液組成；上述引物對(duì)中的每條引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 4pmol/yL0上述的DNA分子、上述的引物對(duì)、上述的PCR試劑或試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞是否為綠殼蛋雞中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述的DNA分子、上述的引物對(duì)、上述的PCR試劑或試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞的基因型中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在上述應(yīng)用中，該待測(cè)雞基因型具體為0/ 0純合型或Ο/ο雜合型；該待測(cè)雞具體為綠殼蛋雞。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞基因型的方法。本發(fā)明提供的方法，為用上述的引物對(duì)或上述PCR試劑或試劑盒中的引物對(duì)對(duì)待測(cè)雞進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若僅得到61Λ大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)雞基因型為或候選為0/0純合型；若得到61Λ和1. Skb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)雞基因型為或候選為Ο/ο雜合型；在上述方法中，該61Λ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；在上述方法中，該1.81Λ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；在上述方法中，該P(yáng)CR擴(kuò)增的模板具體為待測(cè)雞的基因組DNA ；在上述方法中，該P(yáng)CR擴(kuò)增的退火溫度具體為58°C ；在上述方法中，該待測(cè)雞具體為綠殼蛋雞；在上述方法中，該待測(cè)雞的基因組DNA具體來源于離體的雞組織器官或血液。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明鑒定了雞綠殼蛋性狀的原因突變，即由SLC01B3基因啟動(dòng)子區(qū)逆轉(zhuǎn)錄病毒EAV-HP插入引起，插入位點(diǎn)在chrl :673M641_67324642 (UCSC，雞基因組2006年5月裝配)，本發(fā)明提供了插入病毒EAV-HP全序列，該病毒由兩側(cè)315bp的長(zhǎng)末端重復(fù)序列及部分gag、enV基因序列構(gòu)成，本發(fā)明首次鑒定了 0基因的身份，即雞綠殼蛋性狀是由SLC01B3基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒EAV-HP插入引起，該基因及其引物在雞蛋殼色素形成分子機(jī)理研究及雞綠殼蛋基因位點(diǎn)的基因型鑒定中有重要的意義。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為酚仿法提取基因組DNA電泳檢測(cè)
圖2為長(zhǎng)片段PCR檢測(cè)綠殼蛋雞和非綠殼蛋雞SLC01B3基因EAV-HP插入片段基因型
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、EAV-HP片段的獲得1、基因組DNA提取(1)分別從東鄉(xiāng)綠殼純合子雞(0/0)、白來航、藏雞、矮小型褐殼雞(農(nóng)大褐3號(hào))、 東鄉(xiāng)褐殼雞、東鄉(xiāng)綠殼雜合子雞(O/o，由東鄉(xiāng)綠殼純合子雞和東鄉(xiāng)褐殼雞雜交得到)翅下靜脈采血，ACD抗凝(ACD 血液=3:1)。東鄉(xiāng)綠殼蛋雞和東鄉(xiāng)褐殼蛋雞由江西東鄉(xiāng)華綠黑羽綠殼蛋雞場(chǎng)提供，藏雞和矮小型褐殼雞(農(nóng)大褐3號(hào))由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物牧場(chǎng)提供，白來航雞購(gòu)自美國(guó)迪卡育種公司。(2) 30 μ L 抗凝血+300 μ L PBS(lX，pH :7. 2)+300 μ L 禽血裂解液(120g 尿素、IOg SDSUOOmL IM Tris. Cl (pH = 8. 0)、200mL 0. 5M EDTA (pH = 8. 0)，蒸溜水定容至 1L)+20 μ L 20mg/mL蛋白酶K，55°C消化過夜。(3)加入 600 μ L Tris 飽和酚，漩渦混勻 30s, 12000rpm/min 離心 IOmin0(4)取上清液(約500 μ L)，加500 μ L Tris飽和酚和氯仿混合液(1:1)，漩渦混勻30s，12000rpm/min離心lOmin。取上清時(shí)槍頭去尖。(5)取上清液(約450 μ L)，加450 μ L氯仿，漩渦混勻30s, 12000rpm/min離心 IOmin0(6)取上清液(約400 μ L)，加低溫的無(wú)水乙醇600 μ L沉淀DNA。(7)用清潔槍頭將DNA挑入到一個(gè)新的1. 5mL離心管，70%乙醇500 μ L洗滌DNA， 7500rpm/min 離心 5min。(8)小心倒掉70%乙醇，室溫放置20min，待乙醇揮發(fā)干凈后用適量TE緩沖液溶解。(9) 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，提取的基因組DNA，且主帶清晰可見。2、EAV-HP片段的獲得因?yàn)镾LC01B3基因(序列6)的上游的EAV-HP插入片段為引起綠殼性狀的原因突變，所以預(yù)期的檢測(cè)結(jié)果為綠殼蛋雞均存在插入，非綠殼蛋雞均不存在插入。SLC01B3是雞1號(hào)染色體上的一個(gè)基因，它在雞1號(hào)染色體上的物理位置為Chrl 67328451-67343147 (UCSC，雞基因組 2006 年 5 月裝配)。以上述步驟1得到的基因組DNA為模板，以下述F和R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用Taq酶為Takara公司生產(chǎn)的LATaq (貨號(hào)DRR002A)，所用引物序列為F 5 ‘-TGCCTTGTAACTTTGAGGTGG-3，(序列 4)，R :5 ‘-GGTTTCTTCGGTAATTTAGGGTAT-3，(序列 5)。50ulPCR 反應(yīng)體系基因組DNA50-100 ng
2.5 mM dNTP (終濃度為0.4 mmol/L)8 ドL
10 XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus)5 ドL
引物F (20pM，終濃度為0.4pmol^iL)1 ^L 引物R (20pM，終濃度為0.4pmol^iL) 1 ^L
LA Taq (5 U/^iL)0.5 ドL
ddH2033.5 ドLPCR擴(kuò)增條件
94 °C 5 min 94 "C 30 sec 〕 58 °C 30 sec 1-33 cycles 72 °C 5 min 」 72 °C 10 min1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)果如圖2所示，東鄉(xiāng)綠殼純合子雞(0/0) 得到約61A的片段，非綠殼蛋雞(o/o)(白來航、藏雞、矮小型褐殼雞、東鄉(xiāng)褐殼雞)均得到 約1.81A的片段，東鄉(xiāng)綠殼雜合子雞(0/o)得到6 和1.81A兩條目的條帶。經(jīng)過測(cè)序，1. Skb的片段的核苷酸序列為序列表中的序列3 (包括SLC01B3基因 5 ‘段的一部分。)；61A的片段的核苷酸序列為序列表中的序列2(含有序列1)。其中，61A的片段為1.81A的片段在綠殼蛋雞中含有ー個(gè)4. 21A的插入片段，該 4. 2kb為逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄基因，該逆轉(zhuǎn)錄基因的核苷酸為序列表中的序列1(序列2中 自5，末端第909-5107位)，將該病毒名為EAV-HP。將6kb的片段的序列經(jīng)與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc. edu/,雞基因組 2006年5月裝配)雞基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)EAV-HP (序列1)的插入位置為雞基因組的1號(hào) 染色體的Chrl :67324641-67324642 (UCSC,雞基因組2006年5月裝配)間，為插入SLC01B3 基因的啟動(dòng)子區(qū)。實(shí)施例2、檢測(cè)資源群體EAV-HP基因型對(duì)東鄉(xiāng)褐殼雞，因綠殼對(duì)非綠殼為顯性，可以直接根據(jù)其表型判斷出綠殼位點(diǎn)的 基因型為0/0。對(duì)于綠殼個(gè)體，可以經(jīng)測(cè)交驗(yàn)證，鑒定出個(gè)體綠殼位點(diǎn)基因型是0/0，或是0/ O。對(duì)資源群體個(gè)體EAV-HP基因型進(jìn)行了檢查，因?yàn)橘Y源群體中個(gè)體在綠殼位點(diǎn)的基因型 可以通過群體譜系和表型推定，當(dāng)所述資源群個(gè)體在綠殼位點(diǎn)的基因型與其EAV-HP基因 型完全吻合吋，可作為EAV-HP是引起雞綠殼性狀的原因突變的依據(jù)。綠殼資源群體F。由5只純合東鄉(xiāng)綠殼公雞(0/0，F(xiàn)q)(江西東鄉(xiāng)華綠黑羽綠殼蛋雞 場(chǎng)，)與20只東鄉(xiāng)褐殼母雞(0/0，ら)(江西東鄉(xiāng)華綠黑羽綠殼蛋雞場(chǎng))組成，5只東鄉(xiāng)綠殼 公雞經(jīng)測(cè)交證明為顯性純合子(0/0)。Ftl雜交得到F1代，F(xiàn)1母雞均產(chǎn)綠殼蛋(表1)，F(xiàn)1基 因型為0/o,。F1代相互交配得到F2代(表1)。
分別提取F。、F1和F2代雞的基因組DNA，以上述F和R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系和反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同。若僅得到61Λ (序列2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)綠殼蛋雞基因型為0/0純合型；若得到61Λ (序列2)和1. 8kb (序列3)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)綠殼蛋雞基因型為Ο/ο雜合型；若僅得到1. 8Kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)雞基因型為ο/ο。結(jié)果如下表1所示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。表1資源群體EAV-HP插入片段基因型檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞是否為綠殼蛋雞的方法，為檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA， 若基因組DNA中含有目的DNA分子，則所述待測(cè)雞為或候選為綠殼蛋雞；若基因組DNA中不含有目的DNA分子，則所述待測(cè)雞不為或候選不為綠殼蛋雞；所述目的DNA分子為如下1)-3)中的任意一種1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的DNA分子在雞基因組DNA的位置為SLC01B3基因的上游，所述目的DNA分子在所述雞基因組DNA的位置具體為在雞基因組的第一號(hào)染色體的第67324641-673M642位間；所述檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA的方法為測(cè)序、PCR或分子雜交；所述待測(cè)雞的基因組DNA來源于離體的雞組織器官或血液。
3.一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)是否為綠殼蛋雞的方法，用引物序列4和引物序列5擴(kuò)增待測(cè)雞的基因組DNA，若PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度含有61Λ片段，則所述待測(cè)雞為或候選為綠殼蛋雞； 若PCR產(chǎn)物中不含有61Λ的片段，則所述待測(cè)雞不為或候選不為綠殼蛋雞；所述61Λ的片段的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA的方法為測(cè)序、PCR或分子雜交；所述待測(cè)雞的基因組DNA具體來源于離體的雞組織器官或血液。
4.一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞的基因型方法，為檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA，若所述基因組DNA中含有61Λ片段或所述目的DNA分子，則所述待測(cè)雞的基因型為或候選為0/0純合型或Ο/ο雜合型；若基因組DNA中不含有61Λ的片段或所述目的DNA分子，則所述待測(cè)雞不為或候選不為0/0純合型或Ο/ο雜合型；所述61Λ的片段的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA的方法為測(cè)序、PCR或分子雜交；所述待測(cè)雞的基因組DNA具體來源于離體的雞組織器官或血液。
5.權(quán)利要求4所述的方法在鑒定待測(cè)雞是否為綠殼蛋雞中的應(yīng)用；所述應(yīng)用為若所述待測(cè)雞的基因型為0/0純合型或Ο/ο雜合型任意一種，則所述待測(cè)雞為綠殼蛋雞；若所述待測(cè)雞的基因型不為0/0純合型或Ο/ο雜合型中的任意一種，則所述待測(cè)雞不為綠殼蛋雞。
6.一種DNA分子，為如下1) -4)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)序列表中的序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下可與1)或2)限定的DNA序列雜交的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有70%以上的同源性的DNA分子。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求6所述DNA分子的引物對(duì)，所述引物對(duì)具體由序列表中的序列4所示的一條引物和序列表中的序列5所示的另一條引物組成。
8.含有權(quán)利要求7所述的引物對(duì)的PCR試劑或試劑盒；所述PCR試劑具體由權(quán)利要求7所述的引物對(duì)、dNTP、DNA聚合酶和PCR緩沖液組成； 所述的引物對(duì)中的每條引物在所述PCR試劑中的濃度均具體為0. 4pmol/yL0
9.權(quán)利要求6所述的DNA分子、權(quán)利要求7所述的引物對(duì)、權(quán)利要求8所述的PCR試劑或試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞是否為綠殼蛋雞中的應(yīng)用；或權(quán)利要求6所述的DNA分子、權(quán)利要求7所述的引物對(duì)、權(quán)利要求8所述的PCR試劑或試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞的基因型中的應(yīng)用；所述待測(cè)雞基因型具體為0/0純合型或Ο/ο雜合型；所述待測(cè)雞具體為綠殼蛋雞。
10.一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)雞基因型的方法，為用權(quán)利要求7所述的引物對(duì)或權(quán)利要求8所述PCR試劑或試劑盒中的引物對(duì)對(duì)待測(cè)雞進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若僅得到61Λ大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)雞基因型為或候選為0/0純合型； 若得到61Λ和1. Skb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則待測(cè)雞基因型為或候選為Ο/ο雜合型；所述6Kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述1. 8Kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述PCR擴(kuò)增的模板具體為待測(cè)雞的基因組DNA ；所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體為58°C ；所述待測(cè)雞具體為綠殼蛋雞；所述待測(cè)雞的基因組DNA具體來源于離體的雞組織器官或血液。
全文摘要
本發(fā)明公開了雞綠殼蛋基因的克隆及其應(yīng)用，也公開了雞綠殼基因(O基因)的身份及這一發(fā)現(xiàn)在綠殼蛋雞育種中應(yīng)用。在克隆O基因的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供的鑒定待測(cè)雞表型的方法，為檢測(cè)待測(cè)雞的基因組DNA，若基因組DNA特定位置含有部分或全部目的DNA分子，則所述待測(cè)雞為綠殼蛋雞；若基因組DNA特定位置不含有部分或全部目的DNA分子，則所述待測(cè)雞不為綠殼蛋雞。本發(fā)明首次鑒定了引起雞綠殼性狀的O基因的身份，即由SLCO1B3基因啟動(dòng)子區(qū)逆轉(zhuǎn)錄病毒EAV-HP插入引起，插入位點(diǎn)在chr167324641-67324642。雞綠殼基因的克隆對(duì)蛋殼色素形成的分子機(jī)理研究和綠殼蛋雞的分子育種有重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102505047SQ201110370620
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者吳常信, 王哲鵬, 鄧學(xué)梅 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)